Projeto de pesquisa

Colônias (N=7) de quatro espécies de octocorais serão coligidas na região do Parque Natural Municipal Marinho do Recife de Fora, em Porto Seguro, Bahia, Brasil, a saber: as espécies zooxanteladas Plexaurella grandiflora e Phyllogorgia dilatata, e as azooxanteladas Leptogorgia punicea e Muricea flama. Para cada espécie amostrada, as colônias serão transportadas do local de coleta para o laboratório do Projeto Coral Vivo no distrito de Arraial d’Ajuda (município de Porto Seguro, Bahia), de onde serão veiculadas até o CEBIMar/USP.

Em laboratório, cada colônia será particionada em 7 fragmentos, os quais serão aclimatados por um período de 30 dias antes do início dos experimentos, e posteriormente transferidos para aquários em sistema aberto, com temperatura mantida em 26°C (controle) e 29,5 oC (+3,5 oC, tratamento - cenário moderado de aquecimento global, IPCC 2014), por 14 dias. Ao final do experimento, as amostras serão armazenadas em freezer -80 °C para posteriores análises, a saber:

(a) Quantificação da densidade de zooxantela e conteúdo de clorofila a
A densidade de endossimbiontes e a quantificação de clorofila a são utilizados como proxy de branqueamento em corais (Krueger et al. 2015). Cada espécie de coral terá os tecidos retirados com o auxílio de um Waterpik portátil (WP-360) com água do mar filtrada, sendo a densidade de endossimbiontes quantificada por meio de um hemocitômetro (Krueger et al. 2015). A clorofila a será extraída no escuro em N, N-dimetilformamida, a 4°C por 48h que, após centrifugação em 3900 g a 4 °C por 5 min, terá o sobrenadante lido em 646 nm, 663 nm e 750 nm, e a concentração determinada utilizando-se as equações de Porra et al. (1989). Os dados da densidade de endossimbionte e de clorofila a serão normalizados pela área de tecido do coral, e expressos em número de células cm-2 e μg de clorofila a cm-2, respectivamente.

(b) Avaliação da capacidade antioxidante e peroxidação lipídica
A capacidade antioxidante será determinada pelo kit comercial “OxiTMSelect Total Antioxidant capacity (TAC) Assay Kit” (Cell Biolabs, INC) conforme especificações do fabricante. Este ensaio mede o poder redutor de biomoléculas pelo mecanismo de transferência de elétrons, e se baseia na redução de cobre II em cobre I pela ação de antioxidantes como o ácido úrico. Os níveis de LPO serão avaliados por meio da formação de malondialdeído (MDA), um produto do dano oxidativo lipídico que produz um cromógeno mensurado por fluorimetria (Oakes e Kraak, 2003).

(c) avaliação do metabolismo energético via atividade da enzima citrato-sintase
A quantidade de CS em cada célula reflete a capacidade oxidativa da mesma, sendo considerada uma enzima marca-passo (Nelson e Cox, 2014), regulada pela concentração de ATP e com atividade dependente dos substratos oxaloacetato e a ACoA (Hathaway e Atkinson, 1965). A atividade da CS será avaliada por meio da variação da concentração de ACoA, utilizando-se seis diferentes concentrações do substrato (0,1; 0,5; 1,0; 1,3; 2,3 e 3,3 mM). Por sua vez, a concentração de oxaloacetato será fixada em 3,5 mM. Uma vez encontrada a atividade ótima em função da concentração de ACoA para cada espécie, a respectiva concentração de ACoA será, então, fixada e, novamente, a atividade da CS será avaliada através da variação da concentração do oxaloacetato (1,5; 2,5; 3,5; 4,5 e 5,5 mM).

Ao final, o efeito da exposição à temperatura elevada sobre a densidade de zooxantelas, conteúdo de clorofila, capacidade antioxidante, lipoperoxidação e atividade da citrato sintase será avaliado por análises de variância (ANOVA) de 1 fator.