Projeto de pesquisa

Coleção de Tardigrada
Os espécimes serão identificados com base na morfologia externa e interna. Os caracteres morfológicos externos tradicionalmente utilizados para a taxonomia do grupo são as características relacionadas ao corpo; ornamentação na cutícula, papilas bucais, faringe e todas as estruturas duras ali presentes, formato e distribuição das garras, órgãos reprodutivos. Para a identificação e captura de imagens dos espécimes triados serão utilizados microscópios Zeiss com contraste de interferência diferencial (DIC).

As coletas serão realizadas nos locais tipos identificados nas descrições originais e no catálogo de tardigradas marinhos da América do Sul de Miller & Perry (2016): Ilhabela: Orzeliscus belopus Du Bois Reymond Marcus, 1952; Guarujá: Batillipes pennaki Marcus, 1946. No caso das coletas para localizar a espécie limno-terrestre, serão realizadas coletadas nos locais onde o catálogo de tardigradas não marinhos da América do Sul de Kaczmarek et al. (2015) identificou a ocorrência de Milnesium tardigradum, bem como nas publicações de De Barros (1939) e Da Rocha et al. (2017): Estados de Pernambuco, São Paulo, Rio de Janeiro, Paraná, além de outras cidades do interior de São Paulo.

Protocolo de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Logo após a triagem dos espécimes, eles serão transferidos para meio liquido a 60°C por 1 hora e depois para álcool 70%. Após algumas horas, serão imersos em álcool 80, 90, 95 e 100% (por volta de 45 segundos a 1 minuto). Com relação a secagem, o material será submetido ao procedimento de desidratação por ponto crítico, com o equipamento Balzers CPD 30
(temperatura 37oC e pressão 70 kg/cm2), ou pelo uso da substância química Hexamethyldisilazane – HMDS (Gomes-Junior & Da Rocha, 2015). As amostras já preparadas
serão montadas em stubs de alumínio com fitas de carbono específica, metalizadas com uma camada de 10 a 20 nm de ouro, em seguida observadas e fotografadas no Miscroscópio de
Eletrônico de Varredura, marca JEOL, modelo JSM-5800 LV do Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia da Unicamp.

Análises Moleculares
O DNA genômico de cada indivíduo será extraído com auxílio do kit QIAamp DNA Micro Kit (Qiagen) para Tardigrada. Fragmentos dos genes mitocondriais (Citocromo Oxidase Subunidade I – COI), gene nuclear (18S) e gene ribossomal (28S) serão amplificados por meio da Polimerase Chain Reaction (PCR) e com o uso dos primers listados na Tabela 2. As reações de PCR serão feitas com 3 μL de DNA, 12.5 μL de Taq PCR Master Mix (Qiagen), 8.7 μL de água e 0.4 μL (4 pmol) de primers específicos. Os produtos resultantes das amplificações por PCR serão purificados com o kit específico para tal função (Illustra22 ExoProStar 1-Step - GE Healthcare) ou as bandas serão purificadas usando um kit para extração de gel da Qiagen. Por fim, as amostras serão quantificadas e preparadas para o sequenciamento pelo método de Sanger. Será dada prioridade para a realização do sequenciamento no Brasil, no Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida (LaCTAD) da Unicamp em Campinas ou Myleus Biotecnologia em Belo Horizonte. Outras instituições poderão ser consultadas caso necessário