Projeto de pesquisa

Amostragem
As esponjas encontradas em cada local de experimento serão fotografadas in vivo com câmera digital subaquática para facilitar a sua identificação taxonômica. No final do experimento de campo, pequenos pedaços das esponjas serão coletados em sacos plásticos tipo Ziplock® e trazidos rapidamente para o laboratório e processadas imediatamente com o objetivo de confirmar a identidade através da taxonomia clássica e molecular. Todas as amostras obtidas serão processadas no Laboratório de Interações Hospedeiro-Microbiota (LIHM) que está em fase de implementação.
A orientadora da presente proposta possui todas as autorizações oficiais necessárias para coletar as esponjas no litoral de São Paulo (Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado - SisGen, Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade - SisBio e Comissão Técnica Científica - COTEC).

Identificação das esponjas.
A taxonomia morfológica das espécies de esponjas usando caracteres morfológicos e anatômicos será realizada pelo Dr. Guilherme Muricy do Museu Nacional da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Além disto, as esponjas também serão identificadas molecularmente pelo sequenciamento dos genes mitocondrial citocromo-oxidase 1 (COX-1) e nucleares ribossomal RNA 28S, assim como do espaçador interno transcrito (Internal Transcribed Spacer – ITS) que compreende as regiões do RNA ribossomal 18S - ITS1 - 5.8S - ITS2 - RNA ribossomal 28S, procedimentos conhecidos como “Sponge DNA barcoding” (Wörheide e Erpenbeck, 2007). Os detalhes desses sistemas podem ser encontrados no próximo item.

Extração do DNA genômico.
O DNA será extraído de 0,25 g da parte interna do corpo das esponjas como descrito por Hardoim et al. (2012). A extração de DNA será realizada utilizando o kit comercial DNeasy PowerSoil Kit (QIAgen), seguindo as instruções do fabricante. A qualidade de DNA obtido será avaliada em gel de agarose. O DNA obtido será utilizado para a amplificação por PCR dos marcadores filogenéticos: (i) COX1 com o par de iniciadores dgLCO1490 (5’- GGTCAACAAATCATAAAGAYATYGG-3’) e dgHCO2198 (5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAARAAYCA-3’, Meyer et al., 2005), (ii) RNA ribossomal 28S com o par de iniciadores C2 (5’-GAAAAGAACTTTGRARAGAGAGT-3’) e D2 (5’-TCCGTGTTTCAAGACGGG-3’, Chombard et al., 1998) e (iii) ITS com o par de iniciadores RA2 (5’-GTCCCTGCCCTTTGTACACA-3’) e ITS2.2 (5’-CCTGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3’, 9
Wörheide, 1998). Para o COX-1, as condições de PCR serão executadas como descritos por Hardoim et al. (2012, 2013). Para o RNA ribossomal 28S e o ITS, as condições de PCR serão realizadas conforme descrito por Erpenbeck et al., 2016 e Wörheide et al., 2004, respectivamente. Os amplicons serão sequenciados e as sequências serão manualmente checadas conforme descrito por Hardoim et al. (2012, 2013)