Projeto de pesquisa

Modelo
Será utilizada a esponja marinha Hymeniacidon heliophila. A espécie é comum, facilmente identificada em campo e ocorre em áreas acessíveis do litoral de São Paulo (Custódio e Hajdu, 2011), geralmente na zona intertidal onde fica exposta nas marés baixas. Os animais serão coletados em períodos de maré baixa, acondicionados em caixas refrigeradas (18ºC) para o transporte e mantidos em aquários no laboratório de Biologia Celular de Invertebrados Marinhos (IB-USP). A espécie já é utilizada com modelo no laboratório e os envolvidos na execução do projeto possuem experiência prévia com o trabalho de campo e licença para as coletas (28917-1).

Cultura de células
As esponjas serão dissociadas em água do mar artificial sem cálcio e magnésio, suplementada com EDTA (CMFSW+E: 460 mM NaCl, 7 mM Na2SO4, 10 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM EDTA, pH 8,2 - Custódio et al., 1998). Para isso, os indivíduos serão limpos de outros organismos ou detritos e recortados em fragmentos de 2 mm, que serão mantidos em CMFSW+E (5:1 v/v) por 30 min em agitação leve. Após este tempo, o sobrenadante será descartado, sendo novo CMFSW+E adicionado nos tubos, que serão mantidos em agitação leve por mais 45 min. Ao final, o sobrenadante será passado por uma malha de nylon (100 µm) e centrifugado a 250 x g (10 min). O pellet será ressuspendido em água do mar natural esterilizada por filtração (0,22 µm) e suplementada com antibióticos para a remoção de bactérias transientes, e as células colocadas em placas de cultura (1 x 108 cels/mL). O meio será trocado diariamente, e os agregados celulares completamente formados (primorfos) serão recolhidos, lavados em água do mar estéril e transferidos para novas placas de cultura para os experimentos.

Ensaios
Os ensaios serão feitos em placas de cultura com 24 poços, contendo um primorfo por poço e 2 mL de água do mar estéril. Observações anteriores mostram que meios nutrientes líquidos tradicionais como DMEM, RPMI ou L15, têm um efeito limitado ou nulo. Desta forma, os meios utilizados nos testes serão suplementados semanalmente com microparticulado orgânico, que consistirá em Escherichia coli autoclavadas (2x105 cels/mL - Duckworth et al., 2003). As culturas serão acompanhadas em microscópio invertido com contraste de fase (Nikon TE300) com aquisição de imagens digitais. Os efeitos dos ensaios serão verificados observando-se: a ocorrência de adesão ou não dos primorfos; diferenciação e formação de estruturas como canais e câmaras coanocitárias; aumento da massa/proliferação; secreção de espículas ou matriz extracelular. Efeitos deletérios serão verificados pela perda de integridade da estrutura e necrose celular.
Dados da literatura mostram que as quantidades dos íons a serem testados presentes nas esponjas variam bastante dependendo da espécie, do local de coleta e mesmo do indivíduo. Da mesma forma, os trabalhos disponíveis dão valores medidos a partir de diferentes frações do organismo, incluindo ou não tecidos e esqueletos de espículas ou fibras, usando como referência peso seco ou úmido. Sendo assim, as concentrações iniciais testadas neste projeto serão estimadas a partir dos valores de cada íon como descrito para a água do mar “normal” (Turekian, 1968). A partir desses valores serão preparadas soluções com duas, cinco e dez vezes esta concentração (tabela 1). O cálculo da quantidade do sal a ser introduzida será feito pela correspondência molar específica de cada íon testado. Possíveis alterações na osmolaridade das soluções pela adição dos íons serão compensadas nos controles.