Projeto de pesquisa

Coletas:
Serão analisadas amostras provenientes de 12 localidades ao longo da distribuição Siderastrea stellata no Brasil, incluindo 3 ilhas oceânicas e abrangendo profundidades entre 0-46m dependendo da localidade. Quase todas as coletas já foram realizadas: Parcel do Manuel Luiz, MA (N = 5); Natal, RN (N = 30); Atol das Rocas, RN (N = 21); Arquipélago de Fernando de Noronha, PE (N = 30); Porto Seguro, BA (N = 20); Banco do Royal Charlotte, BA (N = 9); Complexo Recifal dos Abrolhos, BA (N = 30); Guarapari, ES (N = 18); Ilha da Trindade, ES (N = 30); Armação dos Búzios, RJ (N = 30) e Arraial do Cabo, RJ (N = 30); faltando somente a coleta na Costa dos Corais, PE/AL. Em cada localidade fragmentos (~ 1cm) de colônias foram coletados em diferentes profundidades quando possível. No Parcel do Manuel Luiz, MA e Banco do Royal Charlotte, BA foram coletados um numero baixo de indivíduos ( 10) devido às dificuldades de coleta e à baixa densidade da espécie nestes locais. Todos os fragmentos coletados foram e serão armazenados em uma solução de lise CHAOS (Tiocianato de guanidina 4M, N-laurilsarcosil 0,5%, Tris pH 8,0 25 μM, 2- mercaptoetanol 0,1M; Fukami et al. 2004) e mantidos a temperatura ambiente até as analises moleculares.
Análise moleculares:
A conectividade e diversidade genética serão estimadas através de análises de RAD-Seq / SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). O DNA genômico total de cada individuo será extraído com o kit de extração DNAeasy Tissue and Blood kit (Qiagen), quantificado no fluorometro Qubit 2.0 e a qualidade das extrações será avaliada por nanodrop e eletroforese em géis de agarose. O sequenciamento RAD-Seq será realizado utilizando o protocolo descrito por Toonen e colaboradores (2013), utilizando as enzimas de corte MboI e Sau3AI em reações de 50uL de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras serão purificadas com o kit Ampure XP na proporção de 1:1,8 (DNA/beads). O kit TrueSeq (120bp) será usado para a construção das bibliotecas, seguindo o protocolo da Illumina TruSeq. Os fragmentos de 400-500 bp serão extraídos utilizando o kit MinElute Gel Extraction (Qiagen), seguindo as instruções do fabricante. As bibliotecas serão sequenciadas no Illumina NovaSeq (GenomaHumano – USP).
Análises de bioinformática:
Após o sequenciamento, os arquivos RawFASTQ serão editados para a retirada de grampos e reads de baixa qualidade (Phred score = 33) no programa Trimmomatic v0.3. A montagem de novo dos contigs será realizada e as sequências de alelos individuais serão então montadas e incorporadas em um conjunto final de contigs de RAD usando o programa Stacks (Catchen et al. 2013). A identificação dos SNPs será realizada com o VARSCAN2 utilizando o comando mpileup2snp. O programa ‘Populations’ no Stacks será usado para identificar loci que estão presentes em pelo menos 80% das amostras em cada localidade. Para evitar desequilíbrio de ligação, será utilizado somente um SNP por loco. Para as análises de diversidade genética, serão calculadas a riqueza alélica, o número de loci variáveis, número de alelos privados, as heterozigosidades observadas e esperadas, assim como os índices de fixação FIS no programa Stacks.
Para as análises de estruturação populacional serão calculadas as distâncias genéticas de Nei e valores de Fst no StAMPP. Além disso será realizada uma análise Bayesiana de agrupamento no programa fastSTRUCTURE v1.0 (Raj et al. 2014), usado para grandes conjuntos de dados. A identificação de FST outliers (loci possivelmente sob seleção) será feita no programa BayeScan v2.1 (Foll e Gaggiotti 2008). As análises de estruturação populacional serão realizadas de duas formas: 1) considerando somente os loci neutros e 2) considerando somente os loci outliers. A identificação de possíveis funções desses loci outlier serão realizadas através de buscas, utilizando a ferramenta BLAST, no site do NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), com sequências correspondentes classificadas por meio de atribuições KEGG (Kanehisa et al., 2008). Taxas e direções de migração serão calculadas usando a função divMigrate, no pacote diveRsity do ambiente R (Sundqvist et al. 2016).