Projeto de pesquisa

A coleta de dados se dará a partir da instalação de ARMS em todas as localidades de estudo, os quais permanecerão submersas por minimamente 12 meses. Cada sítio conta com três estruturas, distando de 2m a 4m entre si, a cerca de 10m de profundidade, assim, favorecendo padronização para a análise dos dados. No estado de São Paulo, as ARMS já foram instaladas e estão recrutando organismos desde março de 2020 e serão somente recuperadas para processamento e substituídas. Quatro conjuntos estão instalados no litoral norte, mais especificamente na ESEC Tupinambás, com as seguintes especificações:
• Conjunto 1: instalado na Ilha de Alcatrazes em março de 2020, próximo a boia do ICMBio em ponto identificado como “Geladeira”. Coordenadas 24°05’49,5” S e 45°41’35,1” W.
• Conjunto 2: instalado na Ilha de Alcatrazes em março de 2020, próximo a boia do ICMBio em ponto identificado como “ESEC”. Coordenadas 24°06’15,2” S e 45°42’05,1” W.
• Conjunto 3: instalado na Ilha das Palmas (Ubatuba) em maio de 2021. Coordenadas 23°32’43,0” S e 045°01’41,1” W.
• Conjunto 4: instalado na Ilha das Cabras (Ubatuba) em maio de 2021. Coordenas 23°31’01,1” S e 045°02’30,6” W.
O processamento destes conjunto de ARMS está programado para ocorrer entre março e maio de 2022. Para os conjuntos 1 e 2, serão utilizadas instalações do Centro de Biologia Marinha (CEBIMar) da Universidade de São Paulo, em São Sebastião e, para os conjunto 3 e 4, a Base Clarimundo de Jesus do IOUSP, em Ubatuba.
A instalação das ARMS da Ilha de Trindade está prevista para ocorrer em expedição entre os meses de agosto e setembro de 2022, com processamento previsto após 12 meses. Serão dois conjuntos de estruturas instaladas em locais a serem determinados na visita ao local, considerando segurança e logística.
A instalação das ARMS em Arraial D’Ajuda, Bahia, está prevista para ocorrer em 2023, com apoio estratégico e logístico do Projeto Coral Vivo, sendo feita também em dois conjuntos de estruturas que serão instaladas no Recife de Fora.
O processamento será realizado seguindo protocolo adaptado do descrito por Leray e Knowlton (2015) e utilizando as EPIs necessárias para evitar contaminação de amostras. A recuperação das estruturas será feita por meio de mergulho autônomo utilizando caixas plásticas que as recobrirão por inteiro e as abrigarão no transporte até um ambiente controlado de laboratório, onde serão completamente desmontadas e mantidas com aeradores. A fauna móvel será removida com auxílio de pincéis e pinças e separada por peneiras de diferentes malhas de 100µm e 500µm. Cada face das placas será então fotografada em alta resolução para, subsequentemente, passarem por uma etapa de subamostragem de organismos sésseis. Ao final do processamento, as placas serão inteiramente raspadas em uma badeja com água do mar filtrada e o material proveniente dessa raspagem será homogeneizado em um liquidificador convencional. Essa mistura resultará em uma massa que será filtrada em uma malha de 45µm com água do mar filtrada. Três tubos Falcon serão preenchidos com aproximadamente 15g deste material resultante que será conservado com solução de DMSO. Estas etapas visam a extração de DNA de grande peso molecular, o que vantajoso nas análises subsequentes.
Identificação taxonômica
Para identificar os organismos das ARMS, será utilizado o método de DNA Metabarcoding, que consiste no sequenciamento de DNA em massa, a partir de uma versão adaptada do protocolo descrito por Leray e Knowlton (2015), buscando a melhor resolução taxonômica possível nas identificações. Cada espécie coletada em campo terá seu DNA extraído utilizando os kits de extração e purificação Qiagen DNeasy PowerMax Soil Kit e Qiagen DNeasy PowerClean Pro Cleanup Kit, respectivamente. O objetivo será amplificar o gene Citocromo Oxidase I (COI) por meio de PCR e a qualidade do material extraído será avaliada a partir de eletroforese em gel de agarose.
Tanto os organismos vágeis coletados através das peneiras, quanto a fração séssil, proveniente da raspagem e homogeneização de fauna incrustante das placas, serão submetidos ao metabarcoding. Organismos vágeis serão divididos em amostras segundo a espessura da peneira em que foram coletados (100µm ou 500µm) e serão submetidos a uma homogeneização para que a extração de seu material genético possa ocorrer posteriormente. Já organismos sésseis terão seu DNA extraído a partir de 10g do material homogeneizado em campo. Após avaliação da qualidade do DNA amplificado, as amostras de organismos vágeis e sésseis serão misturadas para que o metabarcoding possa ser realizado. Os procedimentos até aqui descritos serão realizados nas dependências do Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo (IOUSP), campus Cidade Universitária.
As amplificações, tagging e sequenciamento em massa serão feitos na plataforma Illumina Miseq, no CEFA/ICB-USP. Procurando reduzir o tempo e custo de análise, todas as amostras serão incluídas em uma única rodada. O sequenciamento será então multiplexado com o uso de adaptadores e tags na produção das bibliotecas utilizando o Nextera XT DNA library preparation kit.
Posteriormente ao sequenciamento, os dados gerados serão analisados e filtrados para de-multiplexação, eliminando leituras curtas (250pb), ou aquelas de baixa qualidade utilizando o aplicativo Mothur (SCHLOSS et al., 2009). Para aprofundar o conhecimento e desenvolver novas técnicas de bioinformática para análise destas sequências, propõe-se uma visita ao National Museum of Natural History em Washington (EUA) para realizar um treinamento focado no aprendizado do uso destas ferramentas de análise já existentes.
A partir dos dados obtidos com as sequências e seus cruzamentos com as bases já existentes, poderão ser obtidos dados tanto qualitativos, para a identificação de organismos em diferentes níveis taxonômicos, quanto quantitativos, já que haverá determinado número de sequências para cada táxon identificado. Desta maneira procura-se traçar o perfil da diversidade críptica de todas as localidades de estudo, Arraial D’Ajuda (BA), ESEC Tupinambás (SP) e Ilha de Trindade (ES), comparando-as entre si e com as variáveis bióticas e abióticas presentes para determinar se a natureza e a morfologia de cada um destes ambientes recifais influencia na composição específica e ecologia das comunidades ali presentes. Pretende-se utilizar do pacote Vegan do aplicativo R para explorar estes resultados, avaliando índices de diversidade, além de, tanto diversidade alfa, quanto beta. Procura-se também comparar os dados obtidos com os resultados de outras ARMS de estudos conduzidos em outros países, como o Mar Vermelho, Flórida, entre outros, trazendo âmbito global ao presente estudo.
Com relação às atividades acadêmicas do programas de Pós Graduação, os créditos em disciplinas deverão ser cumpridos durante os dois primeiros anos de vigência do projeto, desta maneira períodos subsequentes podem ser dedicados a análises de dados, atividades de campo, treinamentos e cursos complementares, além de possíveis participações em eventos científicos.