Projeto de pesquisa
Parecer da Comissão Científica
Projeto Externo - de Outra Unidade da USP
Dados do solicitante
Diego Torrecillas Paula Lico
Natureza do projeto
Projeto de docente ou pesquisador
Projeto autônomo
Pesquisadores ou docentes associados
Diego Torrecillas Paula Lico
Roy Edward Larson
Recursos
Processo Fapesp 13151-2
Fapesp
Descrição do projeto
Caracterização molecular e celular de proteínas hnRNPA/B em neurônios.
01-02-2016
31-03-2018
Resumo
Identificamos e purificamos uma proteína ligante de RNA de 65 kDa (p65) como um membro da família de heterogêneo nuclear ribonucleoproteínas, subclasse A/B (hnRNPA/B) nos terminais pré-sinápticos dos neurônios fotorreceptores de lulas (Lico et al., 2010; 2015). A caracterização molecular desta proteína revelou que em lulas há pelo menos 11 transcritos que codificam hnRNPA/B-like proteínas com alto grão de homologia. Entre eles, clonamos e expressamos em bactéria a hnRNPA/B-like proteína 2, que possui propriedades que implicou-a como subunidade da p65. Demonstramos que p65 é um dímero estável em SDS, ureia e DTT composto de subunidades de qual pelo menos uma é hnRNPA/B-like proteína 2 (Lico et al.,2015). Complexos ribonucleoproteínas participam em processos de splicing, translocação e estabilidade de mRNA no citoplasmo, e regulação local-específico de tradução. Recentemente, mutações em proteínas hnRNPA/B foram implicadas em doenças neurodegenerativas, pela indução ou facilitação de formação de corpos de inclusão no citoplasmo. Estes fatos, em conjunto com a localização do p65 na região pré-sináptica de neurônios de lula e a facilidade de isolar os axônios e sinapses gigantes destas lulas, levarem-nos a investigar as propriedades moleculares e celulares do p65.Esperamos que nossos resultados podem contribuir para compreender as propriedades moleculares de p65 especificamente (e proteínas hnRNPA/B-like em geral) e seu papel junto com RNA na regulação da função pré-sináptica.
Identificamos e purificamos uma proteína ligante de RNA de 65 kDa (p65) como um membro da família de heterogêneo nuclear ribonucleoproteínas, subclasse A/B (hnRNPA/B) nos terminais pré-sinápticos dos neurônios fotorreceptores de lulas (Lico et al., 2010; 2015). A caracterização molecular desta proteína revelou que em lulas há pelo menos 11 transcritos que codificam hnRNPA/B-like proteínas com alto grão de homologia. Entre eles, clonamos e expressamos em bactéria a hnRNPA/B-like proteína 2, que possui propriedades que implicou-a como subunidade da p65. Demonstramos que p65 é um dímero estável em SDS, ureia e DTT composto de subunidades de qual pelo menos uma é hnRNPA/B-like proteína 2 (Lico et al.,2015). Complexos ribonucleoproteínas participam em processos de splicing, translocação e estabilidade de mRNA no citoplasmo, e regulação local-específico de tradução. Recentemente, mutações em proteínas hnRNPA/B foram implicadas em doenças neurodegenerativas, pela indução ou facilitação de formação de corpos de inclusão no citoplasmo. Estes fatos, em conjunto com a localização do p65 na região pré-sináptica de neurônios de lula e a facilidade de isolar os axônios e sinapses gigantes destas lulas, levarem-nos a investigar as propriedades moleculares e celulares do p65.Esperamos que nossos resultados podem contribuir para compreender as propriedades moleculares de p65 especificamente (e proteínas hnRNPA/B-like em geral) e seu papel junto com RNA na regulação da função pré-sináptica.
Doryteuthis plei; sinaptossomas; axônio gigante e proteinas ligantes de RNA
A métodologia já padronizada e estabelecida no laboratório está descrita em (Lico et al.,2010 e 2015), inclusive a purificação de proteínas por cromatografia, preparação de sinaptossomas e fraçoes subcelulares, ensaios de oligo (dT) pulldown, identificação de proteínas por espectrometria de massas, análises in silico das sequências, clonagem, expressão e purificação de proteina recombinante, preparação de complexos mRNPs, imuno-histoquimica e imunofluorescência, SDS-PAGE e western blots.
Anticorpos primários: Três anticorpos policlonais foram gerados contra p65 e hnRNPA/B-like proteina 2: a) o anti-squidRNP2 foi gerado em coelhos contra o peptídeo LFIGGLSYDTNEDTIKK, determinado por espectrometria de massas; b) o anti-squidRNPAc foi gerado em coelhos contra a proteína recombinante; e c) o antisquidRNPAg foi gerado em galinhas contra a proteína recombinante. Também, serão utilizados outros anticorpos comercialmente disponíveis como: anti-hnRNP A1, antihnRNP A2/B1, anti-PABP (poly-A binding protein), and anti-Elav (neuronal RNAbinding protein).
Anticorpos secundários: Serão utilizados anticorpos comercialmente disponíveis conjugados com cromóforos fluorescentes para imuno-histoquimica e imunofluorescência e conjugados com enzimas específicas para western blots.
Captura de lulas. As lulas (Doryteuthis pleii, espécie do Atlântico Sul, seguindo a nomenclatura do NCBI) serão coletadas na praia do Jabaquara (Município de Ilha Bela) e praia de Barequeçaba (Município de São Sebastião), litoral norte do Estado de São Paulo, nos meses de verão com o apoio do CEBIMar-USP em São Sebastião.
Anticorpos primários: Três anticorpos policlonais foram gerados contra p65 e hnRNPA/B-like proteina 2: a) o anti-squidRNP2 foi gerado em coelhos contra o peptídeo LFIGGLSYDTNEDTIKK, determinado por espectrometria de massas; b) o anti-squidRNPAc foi gerado em coelhos contra a proteína recombinante; e c) o antisquidRNPAg foi gerado em galinhas contra a proteína recombinante. Também, serão utilizados outros anticorpos comercialmente disponíveis como: anti-hnRNP A1, antihnRNP A2/B1, anti-PABP (poly-A binding protein), and anti-Elav (neuronal RNAbinding protein).
Anticorpos secundários: Serão utilizados anticorpos comercialmente disponíveis conjugados com cromóforos fluorescentes para imuno-histoquimica e imunofluorescência e conjugados com enzimas específicas para western blots.
Captura de lulas. As lulas (Doryteuthis pleii, espécie do Atlântico Sul, seguindo a nomenclatura do NCBI) serão coletadas na praia do Jabaquara (Município de Ilha Bela) e praia de Barequeçaba (Município de São Sebastião), litoral norte do Estado de São Paulo, nos meses de verão com o apoio do CEBIMar-USP em São Sebastião.
A coleta de lulas será realizada no verão (dezembro a março) de 2016 a 2018. A exceção será no ano de 2016 com inicio das atividades em fevereiro a março. O periodo de 2016 a 2018 compreende ao desenvolvimento do processo FAPESP coordenado pelo Prof.Roy E. Larson.
Solicitações
lab com bancadas e torneiras com água doce e salgada;
bicos de tomadas elétricas 110 e 220 v;
bicos de tomadas elétricas 110 e 220 v;
Freezer;
Geladeira;
Lupa;
Geladeira;
Lupa;
Doryteuthis plei
Praia do Jabaquara e Praia de Barequeçaba
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- NEC_STRUCT
- NEC_COLLEC
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