Projeto de pesquisa

A primeira etapa desse projeto tem como objetivo identificar a diversidade da comunidade de micro-organismos (i.e. Bacterias e Archaeas), associados a diversas espécies Cada amostra terá DNA genômico total extraído através do kit DNeasy PowerSoil Kit, visto que o mesmo remove inibidores de PCR, como por exemplo, os ácidos húmicos, em que os corais são ricos. Posteriormente, seguindo o protocolo 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Illumina), iremos montar as bibliotecas que serão sequenciadas utilizando a plataforma MiSeq Illumina. Para isso realizaremos a amplificação do gene 16S rRNA através de reação de polimerase em cadeia (PCR) da região V3 e V4, utilizando marcadores bacterianos universais em conjunto com adaptadores Illumina: Iniciador F = 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCT ACGGGNGGCWGCAG e Iniciador R = 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAG AGACAGGACTACHVGGGTATCTAATC. Posteriormente, será realizada a limpeza da PCR seguindo o protocolo da AMPure XP Beads, e o adicionamento dos indexes utilizando o kit Nextera XT Index Kit, que servem como identificadores de cada amostra. Após uma segunda limpeza utilizando o AMPure XP Beads, cada reação será quantificada e suas concentrações normalizadas. As amostras serão sequenciadas utilizando a plataforma MiSeq. Assim que as sequências forem obtidas, será aplicada uma sequência de análises de bioinformática com o intuito de identificar as bactérias e arqueias associadas a cada espécime de coral. Com os micro-organismos identificados, as análises estatísticas serão realizadas no STAMP - Statical Analysis of Metagenomic Profiles (PARKS et al., 2014), um programa criado para análises de perfis metagenômicos.