Projeto de pesquisa

Para análise de diversidade, foram realizadas coletas de Lineus sanguineus e Prosorhochmus sp em seis sítios distribuídos ao longo de cerca de 1.650 km da costa Brasileira sob a licença de coleta 67004-1. As amostras coletadas estão discriminadas na tabela abaixo. Ao longo do projeto, caso necessário, serão realizadas novas coletas para aumentar o tamanho amostral. As espécies diferem quanto a características reprodutivas, as quais têm efeito direto sobre a distribuição ecológica e da variabilidade genética: Lineus apresenta fase larval planctônica, enquanto que Prosorhochmus apresenta desenvolvimento direto. Para detecção de variação genética nas duas espécies serão amplificados as regiões mitocondriais COI e 16SrRNA e a região nuclear 28SrRNA. Para isso serão utilizados primers universais. As sequências serão alinhadas e analisadas em conjunto e separadamente. Será definido o melhor modelo de evolução para cada sequência antes da reconstrução da árvore através de máxima verossimilhança e método bayesiano. A partir dessas árvores será possível realizar os testes comumente usados para delimitação de espécie, além de uma rede de haplótipos a fim de identificar diferentes unidades evolutivas. Após essa etapa, as análises populacionais serão feitas no pacote Arlequin v3.5 (Excoffier & Lischer, 2010). Parâmetros utilizados para análise intrapopulacional serão o número de sítios polimórficos, diversidade haplotípica, diversidade nucleotídica e a média do número diferenças par-a-par. A análise de mismatch distribution para cada localidade amostradas será realizada, além das análises de expansão populacional recente, Tajima’s D, e and Fu’s Fs (Fu 1996), a fim de obter um panorama demográfico para cada espécie e gene. A fim de inferir o grau de diferenciação genética entre e dentro das amostras, será empregada a análise de variância molecular (AMOVA). Os valores de estruturação de Fst serão inferidos par a par entre localidades amostradas para a mesma espécie sua relação com a distância geográfica será inferida. Por fim, como medida direta de fluxo gênico, será utilizado o pacote Migrate ( Beerli and Felsenstein 2001 ) para estimar migração a longo termo. Essa estimativa M é calculada através da conversão do número de migrantes por geração (xNm), pela fórmula xNm = θi x Mi→j.
Para o estudo funcional da regeneração, serão coletados e utilizados 12 indivíduos de Lineus sanguineus obtidos em mesma localidade. Os animais serão seccionados transversalmente, gerando uma parte posterior e uma anterior. As 12 partes anteriores serão divididas em três grupos (grupo 1a, 2a e 3a), assim como as posteriores (grupo 1p, 2p e 3p). Os grupos 1a e 1p terão o blastema coletado 1 dia após o corte, 2a e 2p terão as regiões recém regeneradas coletadas após 5 dias e 3a e 3p, 10 dias. Será extraído o RNA total das amostras coletadas que em seguida será utilizado para síntese de cDNA. Na análise molecular do processo, primeiramente será verificada a existência dos genes wnt-1 , FoxQ2, gsc e notum em transcriptoma de L. sanguineus obtido pelo grupo de pesquisa, o qual será usado para o desenvolvimentos dos primers. Os genes cuja existência foi verificada terão expressão quantificada por RT-qPCR em amostras de diferentes momentos da regeneração anterior e posterior de Lineus sanguineus. Como controle endógeno da expressão constitutiva serão utilizados genes cujos níveis de expressão gênica sejam inalterados e conhecidos. A expressão de cada gene amplificado será comparada à do gene constitutivo e a expressão relativa será calculada pelo método ΔΔ CP, corrigido pela eficiência de amplificação. É esperado que as diferenças verificadas in silico nas análises de genes diferencialmente expressos sejam confirmadas após a comparação das médias de cada grupo obtidas por qPCR através do teste “t” de student, considerando-se o número amostral de cerca de 72 réplicas para cada gene.