Projeto de pesquisa

Metagenômica de bactérias de Millepora alcicornis
O DNA de todas as amostras será extraído através do kit Qiagen DNeasy Blood & Tissue, seguindo o protocolo do fabricante. O DNA extraído terá sua concentração e qualidade observada através de espectrofotômetro (NanoDrop 2000). O marcador 16S rDNA será amplificado via reação de polimerase em cadeia (PCR) utilizando os primers universais 27F e 519R (LANE, 1991; TURNER et al., 1999) com as concentrações e ciclagens utilizadas em Zanotti et al. (2020). Os produtos da PCR serão purificados através de beads magnéticas (Agencourt AMPure XP) seguindo o protocolo do fabricante e eluídos em 50µl de TE (10mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). A concentração de amplicons purificados será determinada utilizando Qubit dsDNA BR Assay Kit. O preparo das bibliotecas será feito através do NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit e, posteriormente, serão mantidas congeladas até o sequenciamento. Antes do sequenciamento, cada biblioteca será quantificada por meio do Qubit dsDNA BR Assay Kit e seu tamanho será verificado utilizando eletroforese capilar (Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip). O sequenciamento será feito através da plataforma Illumina no Centro de Facilidades de Apoio à Pesquisa (CEFAP-USP).
Transcriptoma de Millepora alcicornis
O RNA de cada amostra será extraído utilizando o Trizol Reagent (Invitogen, USA) de acordo com Chomczynski & Sacchi (1987) e posteriormente dissolvido em água livre de RNase. A pureza do RNA será verificada utilizando espectrofotômetro (NanoDrop 2000) e a concentração será determinada utilizando o fluorímetro Qubit através do kit RNA HS (High Sensitivity) ou BR (Broad Range). Entre 100 à 700ng de RNA serão utilizados para preparar as bibliotecas de cDNA através do kit Illumina TruSeq Strand mRNA LT Sample Prep, de acordo com as instruções do fabricante. Bibliotecas serão equalizadas, agrupadas e selecionadas por tamanho (100bp) antes do sequenciamento. As bibliotecas de Single-end-read (SE) serão sequenciadas na plataforma Illumina no CEFAP-USP.