Projeto de pesquisa

Dez espécies de corais escleractíneos zooxantelados, comuns nos recifes brasileiros, serão coligidas de três ambientes recifais com diferentes níveis de turbidez e sedimentação: Fernando de Noronha (oligotrófico), Maragogi/AL (mesotrófico) e Porto Seguro/BA (eutrófico). As espécies serão, a saber: Agaricia fragilis, Favia gravida, Madracis decactis, Montastraea cavernosa, Mussismilia harttii e/ou M. hispida, Porites astreoides e/ou P. branneri, Scolymia wellsii e/ou Siderastrea stellata. Em cada localidade, diferentes variáveis físico-químicos serão auferidas. Para cada população , indivíduos/fragmentos (N=12) serão coletados, imediatamente armazenados em nitrogênio líquido, e assim enviados ao CEBIMar-USP de onde serão analisados os marcadores fisiológicos e bioquímicos. As demais amostras serão direcionadas para os grupos de pesquisa colaboradores para a avaliação das outras métricas (ecologia trófica e biologia molecular).

- Biomarcadores tróficos, fisiológicos e bioquímicos
Heterotrofia
Serão quantificados três ácidos graxos como marcadores: ácido estearidônico, ácido docosapentaenóico e ácido cis-gondóico. Os dois primeiros são marcadores para autotrofia, enquanto o último é um marcador para heterotrofia (Mies et al., 2018). Os ácidos graxos serão extraídos de acordo com Bligh e Dyer (1959), com as modificações realizadas em Pupier et al. (2021). Os procedimentos de análise cromatográfica serão realizados de acordo com Martins et al. (2018).

Densidades de endossimbiontes e clorofila a
A densidade de endossimbiontes e a quantificação de clorofila a são utilizadas como indicadores de branqueamento em corais. Cada fragmento congelado terá os tecidos retirados com o auxílio de um Waterpik portátil com água do mar filtrada, sendo a densidade de endossimbiontes quantificada por meio de um hemocitômetro (Krueger et al. 2015). Os dados serão normalizados pela área de tecido do coral, e expressos em número de células cm-2 e μg de clorofila a cm-2, respectivamente.

Capacidade antioxidante e peroxidação lipídica
Aproximadamente 0,5 cm2 de cada população serão homogeneizados em tampão específico para cada análise, utilizando-se um sonicador. A fase intermediaria do homogeneizado, contendo o tecido do hospedeiro e dos endossimbiontes, será separada (Krueger et al. 2015) e utilizada para as análises nas diferentes partes do holobionte. A capacidade antioxidante total será medida utilizando-se o kit comercial colorimétrico “OxiSelect™ Total Antioxidant Capacity (TAC) Assay Kit” (Cell Biolabs Inc.,San Diego, CA, USA), o qual é baseado no método de redução do cobre (II) em cobre (I) por antioxidantes. A peroxidação lipídica será determinada utilizando-se o método fluorimétrico descrito por Oakes e Van Der Kraak (2003), o qual baseia-se na medida das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Esta metodologia quantifica os danos peroxidativos em lipídios por meio da reação do malondialdeído (MDA), um dos produtos da peroxidação lipídica, com o ácido tiobarbitúrico (TBA).

- Espécies de simbiontes e filogenia dos corais
Para os simbiontes, o DNA genômico total será extraído por meio de um kit de extração para plantas (QIAGEN), seguindo as orientações do fabricante. Para a identificação dos tipos de ITS2, a região do espaçador interno transcrito 2 do rDNA (ITS2) será amplificada via PCR, utilizando-se iniciadores específicos para Symbiodiniaceae. As amplificações serão purificadas e sequenciadas via Sanger. As sequências obtidas serão mapeadas contra um banco de dados contendo sequencias de ITS2 de Symbiodiniaceae. Para a análise filogenética dos corais, preparar-se-ão bibliotecas baseada em RADseq seguindo os protocolos modificados por Toonen et al. (2013) e Knapp et al. (2016). Após o alinhamento, diferentes modelos evolutivos serão analisados via jModelTest 2 (Darriba et al., 2012). A máxima verossimilhança será calculada utilizando-se o software RAxML v7.2.6 (Stamatakis 2014) com a aplicação de bootstrap rápido e 100 réplicas, enquanto as inferências bayesianas serão obtidas através do MrBayes v3.2.3 (Ronquist e Huelsenbeck 2003).

- Métodos comparativos filogenéticos
Utilizar-se-á um conjunto métodos filogenéticos e pacotes estatísticos na plataforma R (R Development Core Team 2015).