Projeto de pesquisa

As duas espécies de zoantídeos serão coletadas no costão rochoso da praia do Segredo, localizada no município de São Sebastião, litoral norte do estado de São Paulo (SISBIO #82946-2). Após coletados, os animais serão mantidos em aquários de 50 L com água do mar em sistema aberto, portanto com as mesmas condições físico-químicas do ambiente natural. A temperatura será mantida em 26 oC e fotoperíodo de 12/12h claro-escuro, luz em 100 PAR, por 5 dias antes do início dos experimentos.
Depois do período de aclimatação, os indivíduos de cada espécie (N=5) serão submetidos a um choque hiposmótico (0,5 ‰S) e outro hiperosmótico (50 ‰S), por um período de 6 h (tempo máximo de maré baixa), nas mesmas condições supramencionadas. Após essa exposição, o fluido do celêntero será retirado com auxílio de uma seringa acoplada à agulha de insulina e então armazenados para posterior dosagem de íons e osmolalidade. Também será retirada uma fatia do músculo do disco pedal do animal para a determinação do grau de hidratação tecidual, quantificação da concentração de aminoácidos livres.
A concentração dos íons Na+, K+ e Cl- será por fotometria de chama, conforme descrito por Amado et al. (2011). A osmolalidade da hemolinfa será determinada em osmômetro de pressão de vapor. O teor hídrico tecidual será calculado a partir das massas úmida e seca (tecido desidratado em estufa a ~60oC por 24 h), por meio da fórmula: Th (%) = (Pu – Ps) x 100 / Pu , que permite o cálculo do teor de hidratação do tecido (Th) a partir dos valores obtidos de peso úmido Pu e peso seco Ps.
Posteriormente, o volume celular será avaliado in vitro. As células serão isoladas segundo o método de explante descrito por Anjos et al. (2014). Desta maneira, após a remoção do tecido, este será cortado em pequenos fragmentos para que as células se desprendam mais facilmente. Em seguida, fragmentos do tecido serão selecionados e colocados em microplacas de 24 poços para cultura.
A análise do volume celular será realizada em microscópio invertido diante de dois choques, sendo um hiposmótico e outro hiperosmótico, em um intervalo de tempo de 20 min. A lâmina de acrílico contendo as células em solução salina controle será fotografada (tempo 0), e depois será substituída pela solução salina experimental, e então as mesmas células serão fotografadas novamente a cada 2 min até completar 10 min. e depois a cada 5 min. após a exposição à condição experimental. As imagens serão capturadas por uma câmera digital e submetidas à análise de imagens. O diâmetro celular será medido com auxílio do programa Image J e o volume calculado utilizando a seguinte fórmula: V = 4/3πr3
A determinação de aminoácidos livres totais presentes nas amostras de tecido irá se basear no método descrito por Fisher et al. (2001). Este se fundamenta em um método fluorimétrico, em que a determinação dos osmólitos orgânicos se dá a partir da reação dos aminoácidos livres com o o-ftalaldeído (OPA), na presença do agente redutor 2-mercaptoetanol (2-ME ou MET). Assim, resultará em um complexo passível de medição por fluorescência.
A partir dos resultados obtidos, serão calculados média e desvio padrão de cada condição experimental. Serão conduzidas análises de variância de 1 fator (salinidade) após verificação de normalidade e homocedasticidade, e seguidas do teste de comparação de médias múltiplas de Tukey (P0,05).