Projeto de pesquisa

As amostras serão coletadas por mergulho livre na região do infralitoral ou durante baixamares de sizígia em praias ao longo do litoral norte de São Paulo. Outras coletas serão realizadas no Recife de Fora, em Porto Seguro, com apoio do Projeto Coral Vivo. As colônias serão removidas de seus substratos como auxílio de uma espátula e acondicionadas em sacos plásticos contendo água do mar e, em seguida, serão encaminhadas ao Laboratório de Biologia Recifal do Instituto Oceanográfico da Universidade de São Paulo, para identificação do hospedeiro, análise morfológica do simbionte e estudos moleculares. Em laboratório, as amostras serão lavadas com água do mar filtrada e colocadas em placas de Petri estéril, evitando contaminações, para a raspagem da superfície externa das colônias, com auxílio de um bisturi. O material coletado será utilizado na análise microscópica e posteriormente nas análises moleculares. Para as Análises morfológicas dos simbiontes, as células extraídas serão observadas através de microscópio óptico com ocular micrometrada, para facilitar as medições das células e análises taxonômicas. Suas formas serão registradas por meio de fotografias e sua descrição e identificação morfológica será realizada de acordo com HOEK, MANN & JAHNS (1995). A extração do DNA total genômico será realizada utilizando o kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen), seguindo o protocolo do fabricante, com alteração no tempo de incubação. Após a incubação, o DNA será purificado utilizando o kit PowerClean® DNA Clean-Up (Mo Bio), seguindo instruções do fabricante. Esse kit proporciona uma eficiência maior na remoção de substâncias inibidoras da reação em cadeia da polimerase (PCR), garantindo assim melhores resultados. A amplificação do DNA e sequenciamento para análise da microbiota será realizada uma reação de amplificação utilizando os iniciadores (Invitrogen) 27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) e 1494R (TACGGCTACCTTGTTACGAC) (LANE et al., 1991), específico da região do fragmento do 16S do rDNA por meio de PCR. Após a amplificação o produto será examinado usando eletroforese em gel de agarose a 1% com solução tampão e purificadoatravés de um reagente de limpeza de produtos de PCR, kit ExoSAP-IT® (USB Corporation) seguindo as instruções do fabricante. O sequenciamento será terceirizado para empresas como Novogene e Macrogen. Para a reação de sequenciamento será utilizado o kit ABI PRISM BigDye™ Terminator CycleSequencing, ideal para sequenciamento de novo, ressequenciamento e finalização com produtos de PCR, de acordo com as instruções do fabricante.
Para a visualização dos eletroferogramas, alinhamento e obtenção da sequência consenso de DNA,será utilizado uma plataforma de software de bioinformática e biologiamolecular, Geneious. As sequências do gene RNAr 16S e pcbU serão comparados com as sequências no banco do National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando- se BLASTn (Basic local AlignmenteSearch Tool). O alinhamento múltiplo das sequências e a construção da árvore filogenética será realizada por meio do Geneious, e do Mr. Bayes. As sequências obtidas serão alinhadas por meio do algoritmo MAFFT e submetidas a análises de reconstrução filogenética de forma isolada e combinada por métodos de máxima verossimilhança (utilizando o RaxML) e análise Bayesiana (utilizando o BEAST). Os melhores modelos para as reconstruções serão determinados com auxílio do jModelTest utilizando o AIC como critério. Para as análises no RaxML serão utilizadas 1000 iterações de bootstrap. Para o BEAST serão utilizadas 5 milhões de gerações em 4 corridas MCMC simultâneas. Os primeiros 25% das árvores amostradas serão descartadas como burn-in.
Para o desenvolvimento da técnica de cultivo inicialmente a lavagem das colônias será feita com meio tamponado com 10 mM Ácido 2-(N-morfolino) etanosulfônico (MES) em pH5,5. Serão testados meios a pH 5,5 contendo: 1mM indol + serina, 1mM Triptofano e 1mM Ácido Antranílico. As culturas serão mantidas em frascos Erlenmeyer sob iluminação artificial no Banco de
Microorganismos Aydar & Kutner (BMAK).