Projeto de pesquisa

Um mínimo de 20 organismos serão coletados para análises de regeneração, esses que serão identificados no CEBIMar e acondicionados para viagem de volta ao Instituto de Biociências da USP, aonde permaneceram sob luminosidade natural e à uma temperatura de 22ºC.

Para avaliar a capacidade regenerativa dos Lineus sanguineus, serão feitos cortes transversais tais que dividam o organismo em uma porção anterior, a qual preserve as estruturas neurológica do sistema nervoso central e sua boca (aproximadamente dois terços do tamanho original), e também uma porção posterior. Serão procurados sinais de regeneração via formação do blastema a partir da porção posterior e formação do fim posterior na porção anterior. Fotografias serão tiradas diariamente para acompanhamento preciso dos processos regenerativos.

Padrões de regeneração celular e tecidual serão identificados via imunohistoquímica nos organismos, mortos, que estavam em processo de regeneração. Serão anticorpos específicos para proteínas relacionados à proliferação, morte celular e sistemas nervoso e muscular. Detalhes do experimento, que será realizado no Instituto de Biociências, podem ser vistos no arquivo "Projeto escrito" anexado.

Após um determinado tempo do começo de regeneração, alguns organismos serão utilizados para extração de RNA e subsequente sequenciamento, enquanto outros permanecem no experimento de regeneração. A extração será realizada de trechos do organismo regenerando, tanto das porções anteriores (blastema e fendas laterais), quanto das porções posteriores.

A partir do RNA extraído, será procedida a síntese do DNA complementar (cDNA) para se proceder a PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Serão utilizados primers de trechos de DNA que expressam proteínas constitutivas de ambas porções do animal, servindo como um controle, além dos relacionados à proteínas essenciais no processo de regeneração, a fim de avaliar a expressão diferencial desses genes, como o notum, goosecoid, wnt-1 e FoxQ2, cujos primers já foram previamente construídos.

Medidas de expressão relativa serão calculadas pelo método ΔΔCP, corrigido pela eficiência de amplificação. É esperado que os níveis de expressão gênica detectados por RNA-seq sejam confirmadas após a comparação das médias de cada grupo obtidas por qPCR através do teste “t” de student.