Projeto de pesquisa

Cinquenta colônias do coral Mussismilia hispida ocorrentes no costão conhecido como Jardim dos Corais, ilha principal do Arquipélago dos Alcatrazes, litoral norte do Estado de São Paulo, serão subamostradas. Para cada colônia será amostrado um fragmento de aproximadamente 2 cm³, utilizando um amostrador do tipo corer.
A extração do DNA genômico total da amostra será realizada utilizando o kit DNeasy Power Soil (Qiagen) seguindo o manual de instruções do fabricante. A qualidade e concentração do DNA extraído será determinada através de eletroforese em gel de agarose (1%) e espectrofotômetro de microvolumes (NanoDrop 2000)
respectivamente. A amplificação do gene 16S rRNA será realizada através de reação de polimerase em cadeia (PCR) da região V3 e V4, utilizando primers em conjunto com adaptadores Illumina: Iniciador F=5'
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TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG e Iniciador
R=5'GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAAT C desenvolvido por Klindworth e colaboradores (2013), com o kit Phusion High-Fidelity PCR. Cada reação totalizará 30ul de volume final, contendo 6ul de buffer HF, 0,6ul de DNTP, 1,05ul de cada primer, 0,3ul de polimerase, 1,5ul de DNA e 19,5 de água, com cliclagem de 98ºC por 30 s, seguido por 30 ciclos de 98ºC por 10s, 55º por 30s e 72ºC por 20s e por fim, 72ºC por 8 min.
A preparação da biblioteca será realizada seguindo o protocolo ‘16S Metagenomic Sequencing Library Preparation: Preparing 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons for the Illumina MiSeq System’ seguindo as adaptações de Zanotti et al. (2023 em preparação). A concentração final de cada biblioteca será determinada usando o Kit Qubit® dsDNA HS, enquanto o seu tamanho será verificado usando eletroforese capilar (Bioanalyzer High Sensi-chip de DNA de atividade). O sequenciamento será realizado na plataforma Illumina com o kit MiSeq V3 600 ciclos.
Bioinformática
As sequências serão processadas utilizando o software Dada2 (Callahan et al. 2016), remoção de pontas com baixa qualidade, correção de erros, remoção de primer, remoção de quimeras e classificação taxonômica da Amplicon Sequence Variant [ASV] utilizando o banco de dados 16S Silva-138.1. As análises estatísticas serão realizadas após a remoção de sequências de eucariotos, cloroplastos, mitocôndrias, e qualquer outra sequência desconhecida, e contará com análises de variância e testes de post-hoc de Turkey-Kramer (correção com múltiplos testes de FDR de Benjamini-Hochberg de valores de p 0,01 para identificar as frequências relativas de ASVs). Parâmetros de diversidade serão calculados de acordo com a tabela de classificação, como a diversidade Beta e a diversidade Alpha (índice de Shannon e para a riqueza o Chao1). Para comparar a microbiota, será possível utilizar o método estatístico Deseq2, que indica as diferenças significativas entre os grupos. Obtenção de Imagens Subaquáticas.