Projeto de pesquisa

Coleta, Isolamento e Cultivo de Bactérias Marinhas
Diferentes espécies de invertebrados marinhos, com ênfase no Filo Porifera e Cnidária, serão coletados (licença de coleta Prof. Marcelo Kitahara SISBIO: 85497-4) em tubos tipo Falcon estéreis por meio de mergulho autônomo na região de São Sebastião (CEBIMar-USP) identificadas e catalogadas em colaboração com os Profs. Marcelo V. Kitahara e Alvaro E. Migotto (CEBIMar-USP). Uma especime ou fragmento (5 cm3) dela, será coletada para isolamento da microbiota. Durante estas expedições, as amostras serão coletadas tubos tipo falcon estéreis através de mergulho autônomo com alvo especial para amostragens de representantes dos filos Porifera e Cnidaria, os quais serão identificados ao nível de espécie, fotografados (in situ e ex situ) e preservados em: a) solução ultrasalina para determinação de microbioma; b) solução de formaldeído 4% para voucher da espécie. As amostras de sedimento (três amostras por localidade de cerca de 10-20 gramas da porção superior do sedimento utilizando tubos de 5mL) serão preservadas em solução ultrasalina, e por fim, uma vez coletadas, as amostras de água (3 amostras de 1L de água por localidade coletados a cerca de 1m abaixo da superfície próximo ao costão rochoso (utilizando tubos plásticos estereis), serão mantidas em gelo e filtradas em até 6 horas após suas respectivas coletas utilizando membranas de ésteres mistos de celulose de 0,22 μm, e um sistema de filtragem conectado a uma bomba elétrica de vácuo. Os filtros serão fixados em álcool absoluto e armazenados à 4ºC. Em laboratório, utilizando bisturi estéril, um fragmento de aproximadamente 3-5 mm será removido do invertebrado, macerado em água do mar estéril e inoculados em placas de Petri de 90 x15 mm, em um meio rico em nutrientes (Marine Agar DIFCO) e outro com poucos nutrientes (meio ágar em água marinha) (Velasco-Alzate et al., 2019).
Identificação de Isolados Marinhos por Espectrometria de Massas (MALDI-TOF/MS) e Sequenciamento.
Isolados de bactérias marinhas serão cultivados em meio ágar Marine (Difco) em placas de Petri de 90 x 15 mm. As cepas bacterianas que produzirem extratos com atividade antiparasitária/antimicrobiana serão selecionadas para identificação taxonômica, inicialmente por análise fenotípica (morfologia, teste de Gram) e posteriormente por MALDI-TOF/MS Microflex (Bruker Daltonics) (Rahi et al., 2016, Angeletti, 2017) Os isolados bacterianos que produzirem extratos com atividade antiparasitária e não forem identificadas por MALDI TOF/MS, serão selecionadas para identificação por sequenciamento parcial do gene 16S rRNA seguindo um protocolo padronizado (Weisburg et al., 1991) pelo Prof. Marcelo V. Kitahara (CEBIMar-USP).