Projeto de pesquisa

As análises filogenéticas contarão com a maior amostragem possível de táxons terminais para Patellogastropoda, integrando dados de sequências já disponíveis no banco de dados GenBank e sequências inéditas produzidas durante o projeto. Os sequenciamentos inéditos serão realizados majoritariamente a partir de espécimes do Museu de Zoologia da USP, que conta com material de 11 espécies de Lottia não contempladas em estudos anteriores.

As análises filogenéticas serão baseadas nos seguintes marcadores moleculares: (I) o fragmento de barcoding do gene mitocondrial COI, obtido a partir dos primers LCO/HCO; (II) um fragmento do gene mitocondrial rRNA 12S, com primers 12Sma e 12Smb; (III) um fragmento do gene mitocondrial rRNA 16S, com primers 16LRN13398 e 16SRHTB; e (IV) um fragmento do gene nuclear rRNA 28S, com primers LSU5 e LSU1600. Amostras de tecido muscular dos espécimes serão retiradas e passarão pelos procedimentos de extração de DNA e amplificação dos marcadores moleculares por PCR, realizados nas dependências do CEBIMar. Os produtos da PCR serão enviados para sequenciamento por método Sanger pela empresa ACTGene Análises Moleculares Ltda. As sequências obtidas serão importadas ao software Geneious Prime, onde serão montadas de novo e checadas para detectar erros de leitura, avaliar a qualidade das bases (Phred score) e detectar possíveis contaminações.

As sequências de consenso serão alinhadas pelo método MUSCLE e os alinhamentos finais serão submetidos ao software Gblocks para eliminar regiões mal alinhadas e posteriormente concatenados para as análises filogenéticas. As análises serão realizadas utilizando dois critérios de otimalidade distintos: inferência Bayesiana e máxima verossimilhança, utilizando-se respectivamente o programa MrBayes 3.2.6 e o portal PhyML 3.0. Os tempos de divergência entre as linhagens serão estimados através da metodologia de Fossilized Birth-Death Process utilizando-se o software BEAST2, com pontos de calibração temporal baseados no registro fóssil do grupo.

No caso das quatro espécies brasileiras, será realizada uma revisão taxonômica integrando dados genéticos e morfoanatômicos. As distâncias genéticas entre os espécimes sequenciados e a sua posição filogenética serão avaliadas de modo a identificar possíveis sinônimos ou espécies crípticas nas populações estudadas. Os caracteres diagnósticos propostos na literatura serão reavaliados com base em espécimes de populações distintas que contemplem a variação geográfica de cada espécie, também obtidos primariamente do acervo do MZUSP. A análise de caracteres morfoanatômicos terá como foco as seguintes estruturas: concha e mandíbula, que serão analisadas por meio de observação visual e de estereomicroscópios; rádula, que será analisada por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV); e topologia do trato digestivo, que será analisada por meio de microtomografia computadorizada (micro-CT). Por fim, a classificação dessas espécies no gênero Lottia será revisada considerando a sua posição filogenética em relação ao clado da espécie-tipo do gênero.

Sob uma perspectiva biogeográfica, os padrões de distribuição de Lottia serão analisados de modo similar ao realizado em estudos anteriores. No caso das espécies do Brasil, será avaliada a possível correlação entre os tempos estimados para os eventos de cladogênese e eventos geológicos históricos das áreas em que elas ocorrem (e.g., surgimento dos arquipélagos), com os resultados sendo comparados com outros casos similares em Patellogastropoda.