Projeto de pesquisa

Os genomas disponíveis dos organismos meiofaunais previamente citados serão obtidos através de bancos de dados públicos (Tabela suplementar S1). A coleta de espécimes de O. erneba (Nemertea) será realizada em Ilhabela – SP na zona entre marés utilizando o método descrito por Corrêa (1949). A coleta de M. fornerisae e F. kalenesos (Gastrotricha e Kinorhyncha) será realizada na Baía do Araçá em São Sebastião - SP com o auxílio do professor Dr. André Garraffoni e colaboradores do Laboratório de Evolução de Organismos Meiofaunais – UNICAMP, seguindo o método descrito por Garraffoni et al., (2019). A triagem das amostras será realizada no Centro de Biologia Marinha da Universidade de São Paulo - CEBIMAR. Os espécimes coletados para o sequenciamento dos genomas serão mantidos em etanol 99% a – 20ºC até a extração do DNA, enquanto os espécimes coletados para a extração de RNA serão mantidos vivos no Laboratório de Diversidade Genômica - IB USP até o momento da extração. Para estimativa dos tamanhos genômicos, os espécimes mantidos vivos serão submetidos a jejum por 3-4 dias antes da análise de citometria de fluxo, após esse período serão picados com uma lâmina no tampão General-Purpose Buffer (Pellicer & Leitch, 2014) e a suspensão de núcleos resultante será filtrada através de uma malha de nylon de 30 μm e corada com iodeto de propídio em gelo. Por fim, as amostras já coradas serão armazenadas no escuro à 4ºC. As análises subsequentes e a construção do histograma serão realizadas conforme o proposto por Moraes et al. 2022. O DNA será extraído utilizando o kit QIAmp DNA Micro Kit (Qiagen, Xangai). A preparação da biblioteca será feita utilizando o protocolo de preparação de bibliotecas da Pacific Biosciences 20-kb e o sequenciamento PacBio será realizado por uma empresa terceirizada. A qualidade das reads obtidas será verificada com o FastQC v. 0.11.9 (Andrews, 2010). Para estimar os tamanhos genômicos in silico, as frequências de k-mers das reads previamente tratadas serão contadas no Jellyfish (Marçais & Kingsford, 2011), com o tamanho padrão de k-mer igual a 21. Os histogramas resultantes serão utilizados no GenomeScope (Vurture et al., 2017), que estima o tamanho do genoma com base na distribuição de um determinado tamanho de k-mer. O pipeline dnaPipeTE v.1.3.1 (Goubert et al., 2015) será utilizado para montar, anotar e estimar a abundância de elementos repetitivos em cada conjunto genômico. Esse software utiliza amostras de reads com baixa cobertura para montar contigs representativos de repetições com o Trinity v.2.5.1 (Grabherr et al., 2011), e em seguida anota os contigs resultantes com o RepeatMasker (Smit, Hubley & Green, 2013–2015, RepeatMasker Open 4.0.7) e o banco de dados RepBase (Bao, Kojima & Kohany, 2015). O pipeline dnaPipeTE também estimará a abundância dos elementos repetitivos e a divergência entre cópias repetidas em relação aos contigs montados via blastn (Altschul et al., 1990). Ambas as informações são então utilizadas para estimar a distribuição dos elementos repetitivos. Para assegurar a amostragem dos elementos repetitivos, as leituras serão trimadas com parâmetros mais rigorosos no Trimmomatic (Bolger et al., 2014). Para produzir estimativas comparáveis de elementos repetitivos entre as espécies, será utilizado o método de “tamanho fixo de amostragem de leituras” (em vez da cobertura genômica). Para determinar o número apropriado de leituras a serem amostradas, serão realizados testes fornecendo os tamanhos genômicos e utilizando opções de cobertura do dnaPipeTE e os arquivos de saída dessa análise, contendo a contagem de cada classe de repetição anotada por espécie, serão utilizados para as análises estatísticas. Para analisar se sequências de diferentes classes de DNA repetitivo são compartilhadas entre as espécies, será realizada uma análise comparativa com